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造血干细胞移植


造血干细胞移植

造血干细胞移植(SCT)按其干细胞的 来源,分为: (1)自体造血干细胞移植(ASCT) (2)同种异基因造血干细胞移植 (Allo-SCT) (3)异种造血干细胞移植(SCT)。

根据干细胞采集的部位又可分为: (1)骨髓移植(BMT) (2)外周血造血干细胞移植(PBSCT) (3)脐血造血干细胞移植(NCSCT) (4)胎肝造血干细胞移植(NLSCT)

骨髓移植

骨髓移植(简称BMT)是指对病 人实施免疫抑制处理后,使机体失 去排斥异体组织的能力,通过移植 骨髓中的多能造血干细胞给病人, 以重建造血和免疫功能,从而达到 治愈某些疾病的一种方法。

一、骨髓移植种类 根据骨髓的不同来源,可将骨髓移 植分为: 自体骨髓移植(ABMT) 同种异基因骨髓移植(Allo-BMT) 同种同基因骨髓移植(SBMT) 异种骨髓移植

(一)自体骨髓移植(ABMT) 取患者自身骨髓进行保存。 在其相应时间内,用大剂量的放疗和/ 或化疗,最大限度地杀伤患者体内的肿瘤 细胞,然后再输回自体骨髓,恢复患者造血 功能。 此种移植不会出现排斥和移植物抗宿 主病(GVHD)等严重合并症,骨髓移植容易 植活,但极易复发。

ABMT时必须注意以下几个方面: ①肿瘤必须未累及骨髓,移植前骨盆未受过射线 照射。 ②年龄不宜过大。 ③肿瘤必须对放、化疗敏感。 ④自体骨髓移植有利于保护骨髓,免受放、化疗 影响。 ⑤不能防止放、化疗对心、肝、肾等脏器的毒性 损害。

⑥自体骨髓成功的关键是: 保存造血干细胞的活力和基本功能。 骨髓采集后如置于常温下,骨髓在培养液 或保存液内最长不能超过72小时。 因此大剂量放、化疗须在短时间内完 成,或者有时难以忍受。 在-196℃长期保存。

⑦对缓解期肿瘤(尤其是血液系统的白血 病和多发性骨髓瘤)进行BMT,采集的骨髓 最好能行体外净化,去除残存的肿瘤细胞, 否则移植后复发率极高。 ⑧移植后不出现GVHD,就不会出现抗肿瘤 效应,故复发率极高。

(二)同种同基因骨髓移植(SBMT) 在人类仅限于同卵双胎间的移植,这 种机会极少。因无供受者间免疫方面的障 碍,无需免疫抑制处理,也不会出现排斥和 GVHD,因而临床效果较好。 倘若用于治疗白血病、多发性骨髓瘤 等血液系统恶性肿瘤,移植后复发率比 Allo-BMT要高,这可能与缺乏移植物抗肿 瘤效应作用有关。

(三)同种异基因骨髓移植(Allo-BMT) 是指供一受者之间主要组织相容性复合物 (简称MHC)相合的同种两个个体间的移植。 目前开展的是基因型相同或基本相同的兄 弟姐妹间的移植,少数为亲子间的移植,也有人 类白细胞抗原(简称HLA)表型相同的无关人员之 间移植,此种移植机会极少。 易并发GVHD,但其优点是移植后疗效比ABMT 和SBMT佳。

二、供受者选择: (一)受者(患者)选择应注意: (1)年龄控制2~50周岁。 (2)选择合适的移植时机,如:急淋高危组 和急非淋CR1后,低危组急淋则在CR2后;慢 性粒细胞性白血病在慢性期的早期(发病 一年以内),而重型再生障碍性贫血应尽 早移植。

(3)无急慢性感染病灶。 (4)左心室射血指数>5.0、用力肺活量 (forced vital capatity)≥60%、一氧化 碳弥散能力(DLCO)≥50%。 (5)血肌酐<110μ mol/L(2mg/dl)和总胆 红素<18μ mol/L(<2mg/dl)。

(二)供者选择: 首选HLA配型相合的同胞兄弟姐 妹为供者,如有两个以上供者应选择 与患者ABO血型或性别相同者。 也可选择单倍型相同的家庭成 员作为供者。

选用HLA表型相同或相似的无 关人员作供者,由于HLA的高度多 态性,使其概率甚小。

三、同种异基因骨髓移植(Allo-BMT)和同 种同基因骨髓移植(SBMT) (一)移植步骤: 1.供受者红细胞血型检测及HLA配型, 应用PCR进行HLA-A、B、C、DR抗原分型, 且HLA相同供受者进行混合淋巴细胞培养和 淋巴细胞毒交叉试验。

2.供者准备: 详细询问供髓者的病史和全面体 检,对血、骨髓及心、肝、肾、免疫 功能等进行检查。骨髓检查包括常规 分类、粒-单集落形成测定(GM-CFU)、 染色体分析,此外还应检查血清巨细胞 病毒等病毒抗体滴度和华康氏反应。

如为同性供者应查红细胞同 工酶和血型(包括亚型),以此作为 移植后骨髓是否植入的依据。 另外,供髓前4周开始采用 自体血保存法储备自体血600~ 800毫升。

3.受者准备 预处理前应仔细体检; 进行痰、尿、粪便、皮肤、耳、鼻、咽拭 子细菌、真菌培养; 预处理前一周开始口服肠道抑菌剂,; 洗必泰液漱口,洗必泰甘油涂鼻、外耳道, 利福平眼药水滴双眼等; 注意肛周清洁卫生。

实验室检查主要包括骨髓、血 及心、肺、肝肾功能等检查。除做与 供者相同的项目外,还应查肺功能、X 线胸片、如有条件者可做有关内分泌 方面的检查。

入层流室当天剪指甲,剃尽全身毛 发,清洁淋浴后用洗必泰液药浴20~30分 钟,着无菌衣、帽、口罩,用无菌单包裹送 入无菌层流室。 入室后保持无菌环境,进无菌饮食,热 量、蛋白质和维生素补充要足够。 工作人员严格进行反向隔离。

4.骨髓移植前预处理 预处理目的是抑制受体免疫系 统,不使移植的供体造血干细胞被 受体所排斥。各疾病预处理的方案 很多。

(1)再障和非肿瘤性疾病: ①方案一:单一环磷酰胺(CTX)静滴。 ②方案二:环磷酰胺和全身照射 (CTX+TBI)。 (2)白血病: ①方案一CTX+TBI ②方案二:CTX+柔红霉素+TBI

骨髓采集 在手术室内对供者进行骨髓采集。 一般应用硬膜外麻醉,采髓部位以骼 后上棘为最佳,也可在骼前上棘或/和 胸骨或/和棘突部位,儿童则需加胫骨 处,以多点和不同深度采髓,每点采 10~15ml骨骼血,总量10~ 15ml/Kg(600~1000ml)。

移植骨髓所需的有核细胞数应按 受(患)者体重和根据供体来源而定: (1)SBMT需3.0-5.0×107/Kg (2)Allo-BMT需》2.0-6.0×108/Kg 当采集到400ml时,应开始回输事 先采集的自身贮备血,以防休克,术后 需补充各种造血因子。

(2)过滤 通过17、18号针头二次过滤,或 不锈钢网(孔径0.201~0.307mm)过滤 后注射至血袋或采集瓶中。一般吸取 的骨髓用生理盐水或1640稀释液肝素 抗凝,每毫升骨髓血需含肝素15~20 单位,以防骨髓血凝集。

(3)骨髓回输 ★从受者锁骨下大静脉插管内输入。 ★输入前将装有骨髓血的采血袋或采集 瓶倒置半小时,使骨髓中脂肪浮于上层, 输注即将结束时,弃去浮在上层的脂肪 滴,以防发生脂肪栓塞。 ★输毕后须应用采髓时所用肝素剂量的 同等剂量鱼静蛋白(1mg鱼精蛋白中和 100u肝素)。

(二)Allo-BMT骨髓植活标准 (1)植活的直接证据: ★受者体内出现供者型的性染色体,标记 型染色体, ★HLA(I、II、和III类)抗原,红细胞、 粒细胞和血小板抗原, ★红细胞与白细胞同工酶,同种异型免疫 球蛋白以及其它基因标记等。

(2)植活的间接证据:受者发生急、 慢性GVHD。 (3)骨髓重建的证据:移植后2-4 周,受者网织红细胞、粒细胞、淋巴 细胞和血小板迅速增高,并逐渐重建 造血免疫功能。

四、自身骨髓移植 (一)自身骨髓的采集和保存 骨髓的采集在手术室内予以硬膜外麻 醉下进行,儿童则采用全身麻醉。穿刺部 位选择在左、右前后髂上棘和胸骨,儿童 可选择胫骨上端等部位。 ABMT需有核细胞总数5.0~30.0×109 (0.5~5.0×108/kg体重),骨髓粒系祖 细胞(CFU-C)平均1.0~4.0×104/kg体 重。

骨髓液按等量比例与保养液混和, 经不同孔径(0.201~0.307mm)的不 锈钢滤网,滤去骨髓中脂肪颗粒和碎 片。在混有红细胞和骨髓液中每亳升 加入肝素15-20U, 4℃保存36~48小 时后回输。也可应用10%二甲亚砜作 为骨髓冷冻保护剂,使骨髓保存于- 196℃的液氮中。

(二)骨髓净化 目前国际上将净化方法分为两大 类:即负净化也称阴性选择:将肿瘤 细胞从移植物中清除掉;正净化也称 阳性选择:将正常造血干细胞从移植 物中分离纯化。临床上应用方法多为 负净化。但无论是物理学、生物学或 其他方法都还不够理想。

(三)自身骨髓移植前预处理 ABMT的预处理目的是:①使骨髓 产生一定空间,使造血干细胞有植入 和增殖的场所;②进一步清除体内肿 瘤细胞。 精典的方案CTX加全身照射(TBI) 或分次全身照射(FTBI)进行预处理。 肺需要适当屏蔽。

(四)骨髓回输:同前 (五)自身骨髓移植后造血功能恢 复(植活标志) ABMT后外周血白细胞从无恢复 到1.0×109/L平均需16-21天;血小 板恢复50×109/L平均需14-21天, 粒细胞恢复>0.5×10 9/l,平均21天。

外周血造血干细胞移植

一、外周血干细移植类型 外周血造血干细胞移植可分为: (1)自体外周血干细胞移植(APBSCT) (2)异基因外周血造血干细胞移植 (Allo-PBSCT)。 供受体选择及移植前准备同骨髓 移植。

二、外周血干细胞的动员与采集 (一)动员 在正常生理条件下,外周血干细胞 数量很少,只有骨髓造血干细胞量的 1~10%,因此,不能满足临床PBSCT 数量的需要。常用动员剂有以下几类: 1.重组人造血生长因子

2.抗肿瘤化疗药物 (1)最大限度地杀灭患者体内的肿瘤细 胞; (2)在杀伤肿瘤细胞同时,也使正常造 血细胞受到损害,但由于正常造血细胞恢 复时间比肿瘤细胞短,故当骨髓抑制解除 时和正常造血细胞恢复之际,外周血干细 胞数量反馈性增加达25~100倍,从而起 到了造血干细胞动员效果。国内常用药物 有环磷酰胺;阿糖胞苷。

采集前动员方案选择要根据恶性肿瘤的 类型和患者的具体情况而定。 白血病或恶性淋巴瘤晚期等血液系恶性 肿瘤作自身的PBSCT时,以选择抗肿瘤化疗 药物作为动员剂量为适宜。 而对于Allo-PBSCT供者宜选用GM-CSF 或G-CSF。

(二)采集 1.采集时机选择: (1)动员化疗结束后2-3周,外周血白细 胞计数升至(1.0-2.0)×109/L时。倘若单 用G-CSF动员宜在白细胞计数升至(5.510.0)×时,血小板计数?50×109/L; (2)外周血CD34阳性细胞?1%(正常为 0.2?0.1%)。但采集时机仍需根据患者的 当时情况而定。

2.方法: 运用血细胞分离机如Fenwall CS3000,分离3-4次或COBE SPECTRA分离1-2次,直至采集到 造血功能重建所需的细胞数。

四、外周血干细胞净化 净化方法有也是二种:阳性选择和 阴性选择。 五、外周血干细胞体外扩增 为了确保PBSCT后成功的造血重建, CD34+细胞不应低于2.5×106/kg。因此, 可采用部分CD34+细胞进行体对扩增。

六、外周血干细胞的冻存 通常每次经血细胞分离机分离 后所得的细胞悬液约50ml,可加入 等量20%二甲基亚砜(DMSO)和 RDMI1640保养液,使DMSO的最终浓 度调整至10%。然后分装于血液冻 存袋内(每袋100ml)。

采取二步降温法: 第一步先1℃/min速率降至-45℃, 第二步则以5~10℃/min降至- 80℃~-90℃,程序结束后,最后将 样品置于-196℃液氮中贮存。

当需要应用时,回输前将冻存的外周 血干细胞悬液立即置入40~42℃水浴中 3min内迅速解冻, 然后低温离心去除含DMSO上清液。 加等量RPMI1640保养液稀释,每次输 注400~600ml,在1小时内静脉输完毕。

七、外周血干细胞移植后植活特点 外周血干细胞移植后,其外周血移 植后中性粒细胞(PMN)上升常出现二个 峰值。 第一次峰值即在PMN恢得到? 0.5× 109/L,平均出现在移植后11天,随后呈一 度下降趋势,然后约在第3~4周时再次出 现第二峰值,至后白细胞恢得正常。

目前认为第一次PMN峰的出 现是由于外周血中较晚造血祖细 胞增殖分化的结果;第二次峰值 的出现则是由于较原始造血干细 胞增殖分化的结果。而血小板升 至? 50.0×109/L平均时间为13天。

脐血造血干细胞移植

70年代发现脐血中含有丰富造血 细胞、其数量和质量与骨髓相似。80 年代末则用脐血代替骨髓行造血干细 胞移植获得成功。因此许多国家相继 建立脐血库,我国也正在筹划之中, 以期有可能解决异基因造血干细胞移 植中遇到的一些难题。

一、脐血的采集 脐血可通过脐静脉穿刺收集,有两 种方式: (1)胎盘娩出前收集; (2)胎盘娩出后收集。 采集脐血时,可用肝素、ACD(枸橼 酸、枸橼酸盐和葡萄糖)和CPD(枸橼酸 盐、磷酸盐和葡萄糖)作为抗凝剂。

每个胎盘可采集量为42-240(中位数 103)ml,其中约含有核细胞1.0~2.0×10 9/l,单个核细胞(MNC)1.0×109,CD34细胞 1.0×107 理论上估测足可供体重50公斤以内的 患者移植之用。

二、脐血分离与保存 脐带血中的造血细胞可通过羟乙 基淀粉沉淀法、密度梯度分离法、流 式细胞仪分离法及单克隆抗体法等, 物理生物学方法分离获得。 冻存的主要步聚:(1)程控加入20% DMSO(每分钟加体积的5%,边加边搅 拌);(2)程控降温、冻存。

三、脐血造干血细胞扩增 原因: 单个脐血中造血干细胞数量有限。 另外,在脐血样品分离、冻存、融化、处 理和输注等各个环节中还要损耗一部分细 胞,因此不能满足成人造血细胞移植的需 要。 扩增过程还可清除移植物中残留T淋巴细胞 和肿瘤细胞的作用,减少GVHD的发生率。

四、脐血造血干细胞移植后植活特点 (1)受者外周血中性粒细胞绝对值(ANC) ?5.0×109/L恢复所需时间:同胞相关供者 平均为22天,而无关供者平均为24天。 (2)血小板计数?5.0×109/L 恢复所需时 间:同胞相关供者平均为48天,而无关供 者平均为54天。

胎肝造血干细胞移植

1958年Uphoff首先发现对致死剂量照 射小鼠输注胎肝细胞悬液后具有促进骨髓 造血功能恢复的显著疗效。人们发现胎龄 为3~6个月胎肝含有极其丰富的造血干细 胞,它和骨髓造血干细胞相比,有着类似 的增殖分化和重建骨髓造血功能的能力, 且此时淋巴细胞量小于2%,且多为未完 全分化成熟的T淋巴细胞.因此,故移植后 GVHD的发生率低及严重程度轻。

一、胎肝造血细胞制备 人胎肝可以取自水囊引产、前列腺素 引产正常胎儿。在无菌条件下,取得肝脏。 将肝脏置于培养皿中剪成细小块。然后, 投入装有双层或单层高压灭菌处理的铜网 (孔径100-200目)的小烧杯,然后倒入 约20ml的液体,并用10ml注射器针芯将肝 组织块研磨成浆状,收集在无菌瓶中,并 通过带4号针头的注射器制成单细胞悬液后 备用。

三、胎肝造血干细胞分离与贮存 (一)胎肝造血干细胞分离 在正常肝组织中近半数肝细 胞和1%的T淋巴细胞,因此,分 离除去这些非造血细胞有利于胎 肝造血干细胞的超低温贮存。

采用直径为15mm的10ml角度离心 管以及聚蔗糖一泛影葡胺分层液,胎 肝细胞在4℃下经非连续密度梯度离心 (1500转/min)20min后,收集界面层 的单个核心细胞。此时,肝细胞已基 本被去除,而粒巨核细胞集落形成单 位(CFU-GM)回收率为74~89%。

(二)胎肝造血干细胞贮存 将分离的胎肝细胞中的单个核细 胞悬液与二甲亚砜保存液1:1比例混 合后,置入低温贮存袋内,然后按二 步降温法降温。

造血干细胞移植 合并症和并发症

一、移植物抗宿主病

二、感染:在移植过程中感染是 常见的合并症,也是移植失败的重 要的原因之一。
三、间质性肺炎(IPN):是All0- BMT后仅次于GVHD第二位致命性并发症, 发生率约为40。

四、肝静脉闭塞病 五、出出血性膀胱炎(HE) 六、渗透综合症(或称肺水肿综合症) 七、移植排斥 八、出血 九、其它:移植后出现的晚期并发症有白 内障、白质脑病、甲状腺功能低下、性腺 功能低下、儿童生长发育迟缓、以及继发 第二肿瘤等。

造血干细胞移植 适应症及临床应用

一、适应症及临床应用 (一)急性白血病 (二)慢性粒细胞白血病(CGL) (三)恶性淋巴瘤 (四)多发性骨髓瘤 (五)重型再生障碍性贫血 (六)遗传性疾病 (七)实体肿瘤

脐血造血干细胞移植前景: (1)脐血移植所需有核细胞数量较少,可供 儿童应用;若进一步增加采集量,改善处 理过程,其造血细胞数足敷成人移植之用。 (2)脐血淋巴细胞大部分为幼稚型T淋巴细 胞,功能不成熟,HLA不合的移植后,GVHD 较同类骨髓移植(BMT)少而轻。

(3)脐血造血细胞进入细胞周期的细胞多, 有利于基因导入,有可能成为基因治疗的 理想靶细胞之一。 (4)脐血造血细胞能够长期深低温保存,可 作为自体移植贮备之用。 (5)脐血采集不对供者造成任何痛苦和不利 影响。



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